电穿孔
一、电穿孔理论
1.1 脉冲电场产生
生物组织充满在两电极之间，并与储能电容C连接，如图1所示。当开关K闭合(t=0)，放电回路接通，具有脉冲电压初值U0的电容向生物组织放电，并且脉冲电压U随时间呈指数下降，如图2所示。当脉冲电压U下降到电压初值U0的37%，所经历的时间称为时间常数t，并且t= Rp(C+Cp)。一般地，组织电容Cp远小于储能电容C，Cp可以忽略，则时间常数t为t = RpC。当t=3t，U(t)/U0=5%；当t=5t，U(t)/U0= 0.7%。可以认为脉冲电压下降到电场初值0.7~5%的时间称为脉冲持续时间Td，Td=(3~5)t。当开关K打开(t=Tw)，放电回路断开，储能电容终止向组织放电，时间Tw称为脉冲宽度。当脉冲宽度大于脉冲持续时间，Tw>Td，电容放电充分，可以得到完整的脉冲电场波形。当脉冲宽度小于脉冲持续时间，Tw<Td，电容不能充分放电，部分电荷保留在电容中。
图1 脉冲电场发生
图2 脉冲电场的波形
1.2 电穿孔的形成
电穿孔是基于细胞膜快速(400ns)充电达到1V，膜电阻可逆地降低约9个数量级。脉冲电压进一步提高，而膜电位不会提高，在脉冲电压超过膜电位而产生了膜破裂。破膜之后，细胞膜可以保持机械稳定性，再充电可以得到相同的结果，这就是可逆电穿孔现象。
图3 细胞膜电穿孔
电穿孔实验主要有三种实验系统：细胞悬液、个体细胞和双分子层脂质膜(BLM)。每一种实验系统都有其特点和不足，但有一个共同的特点就是膜在扩大外电场中起着很重要的作用。例如，在外电场Ee作用下，非导电性球形细胞表面的电位分布可以用laplace方程表示：
U=1.5rcellEecosθ
其中U是跨膜电位，rcell是细胞半径，θ是膜法向与外电场方向之间的夹角。75％的电位降落在膜法向与电场方向相同(θ=0)或相反(θ=π)方向的区域，跨膜电场Em要大于Ee。外电场最大扩大程度Em/Ee=1.5 rcell/h=2×103。如果细胞半径rcell=10μm，膜厚h=5×10-7cm，跨膜电压至少应大于0.5V，外电场强度至少300V/cm。
BLM电穿孔的一个重要特点是在孔洞形成前，细胞膜阻抗比较大，在膜变化后电极电压与跨膜电位最终达到相等。细胞膜充电后依赖于跨膜电压初步形成稳态电流，之后，出现明显的电流急剧波动，不可逆地增长，直达饱和值。在饱和区域内，跨膜电压降低，表明膜已经破裂。膜电导和膜生命时间都显示出随机行为，表明膜破裂不是一个单纯确定性的机制在起作用。
脉冲电场对膜的作用结果可分为两种形式：
1. 膜穿孔：是脉冲电场作用下短时间内发生的最直接的结果，出现一个或多个“超临界孔洞”（supercritical pores），这些孔洞会不断扩大直到达到膜边界；
2. 作用减退：是电穿孔的后续反应。高强电场会产生非热力学不可逆作用，即细胞杀伤作用。
1.3 孔道能量
电穿孔孔道形成可以用“甜饼刀”(cookie cutter)模型描述：用一个圆形刀切一个没有孔道的膜，当跨膜电压U=0，孔道圆周上的能量2prEd(Ed为能量线密度)与无孔平面膜的能量pr2Er(Er为能量面密度)差ΔWp(r)= 2prEd-pr2Er为孔道能量函数，如图4。由于孔道电介质介电常数比膜脂质介电常数大得多，孔道半径随着跨膜电压U的增大而减小，相应的孔道能量ΔWp也减小，膜产生孔道的可能性增加。
图4 脂质双层的能量分布
皮肤具有阻碍外源物质进入人体的功能，自然状态下物质是不能通过皮肤进入人体，只有用物理或化学的辅助方法促进物质经皮渗透。物理方法包括了离子导入、电穿孔、超声导入、压力波、微针]等技术。近年来，发现电穿孔可以促进大分子药物的经皮渗透，这为生物技术制备的药物制剂，如蛋白质或多肽类药物的给药途径提供了一种新的技术，具有极高的应用价值。
消融区域的能量特性经验公式为：
拟合参数Am和β与U0的关系有：
1.4 脉冲电场积
脉冲序列电场积(stream PEFI，sPEFI)为：
sPEFI是脉冲电场强度(或脉冲电压和电极间距的结合)、脉冲宽度、脉冲数的综合电脉冲参数。消融区域的sPEFI特性经验公式为：
经验公式参数Am=6.4mm2，α=0.0035。
1.5 可逆电穿孔与不可逆电穿孔
电穿孔程度是由脉冲电场强度、脉冲持续时间，以及生物组织或细胞电学特性所决定，存在无效应、可逆电穿孔、非热不可逆电穿孔、热效应等四种情况。当脉冲电场强度和脉冲持续时间较小时，不产生任何生物效应。当脉冲电场强度和脉冲持续时间达到一定程度，细胞膜穿孔，产生一定的生物效应，为可逆电穿孔。当超过细胞的承受能力，可导致细胞死亡，发生不可逆电穿孔。当脉冲电场强度、脉冲持续时间足够大，电场能传递到电极周围组织，其焦耳热增加，导致热效应。热效应可发生热损伤(温度>50°C)，取决于达到的最高温度和维持该温度的时间，这些因素会受到血管散热以及组织热扩散等的影响。
图5 电穿孔效应热图
二、经皮给药
2.1 意义
经皮给药是将物质，如药物，通过皮肤进入血液的一种给药的方法，为注射、口服等给药方式的另一种方法。经皮给药有以下优点：
1.避免口服药物在消化系统中肝脏“首过效应”和胃肠道各种酶降解作用；
2.避免见到针头的恐惧，尤其是儿童，降低针刺的疼痛；
3.在辅助给药装置的帮助下，实现自动按时给药管理，保证体内血药浓度稳定；
4.提高给药的依从性。
图6 给药的峰血药浓度
皮肤具有阻碍外源物质进入人体的功能，自然状态下物质是不能通过皮肤进入人体，只有用物理或化学的辅助方法促进物质经皮渗透。物理方法包括了离子导入、电穿孔、超声导入、压力波、微针]等技术。近年来，发现电穿孔可以促进大分子药物的经皮渗透，这为生物技术制备的药物制剂，如蛋白质或多肽类药物的给药途径提供了一种新的技术，具有极高的应用价值。
2.2 电穿孔技术
阻碍物质经皮转运的主要成分是表皮上的角质层。表皮最外层是由20层左右角质细胞组成的角质层, 角质细胞被由胆固醇、自由脂肪酸和酰基鞘氨醇组成的脂质域所包围和分隔, 这种结构就象图6所示的砖墙结构, 红色部分为角质细胞, 白色部分为脂质域。脂质域是一些带有约30~40Å厚的亲水基团和15~25Å厚的疏水基团的双分子脂质层(BLM)。亲水性物质可以有皮肤附属器、脂质弯曲和脂质——角质细胞直线三种途径转运。自然状况下，皮肤附属器是物质转运的主要途径, 但对大分子物质的通透性很低。因此, 角质层是皮肤对药物分子转运的主要屏障。
图7 脂质——角质细胞直线途径
经皮给药电穿孔技术是在皮肤上施加脉冲电场，使皮肤角质层产生新的孔道，建立脂质——角质细胞直线药物渗透途径。脉冲电场通过药盒中同轴电极施加在同侧皮肤，图8。
图8 经皮给药电穿孔技术
2.3 经皮渗透率
药物经皮渗透实验一般是在扩散池系统中进行。药物经皮渗透率是指在单位时间内，扩散池系统供应室的药物穿过单位面积皮肤到达接受室的质量。脉冲电场强度和脉冲持续时间是影响药物经皮渗透率的主要电学参数，然而，药物经皮渗透率随着脉冲电场能量的增加而单调增加，图8是胰岛素经皮渗透率。
图9 胰岛素经皮渗透率